问：实验室的水平转子型号为sw 41 Ti，这个配套的离心管只能装很少量的体积，使用外泌露前应当需要浓缩，将500 mL上清采用超滤管（100KD）浓缩至低体积，再根据说明书添加外泌露提取外泌体，可行吗?

答：可以利用超滤管浓缩。

问：先采用角转子（8支管，每只管约25mL上清，一次可超离200mL），在每只管里添加外泌露进行浓缩（说明书要求通过预实验，确定加500 μL-2 mL 的外泌露，摸索条件是否以清晰看到分层为准？是否外泌露加的多，分层就更清晰？）。再收集管底部分外泌体粗提溶液（“从底部缓慢小心吸取250 μL 液体，弃去；再收集底部150 μL”是这样操作吗），最后通过sw 41 Ti水平转进行纯化超离（“从底部缓慢小心吸取250 μL 液体，弃去；再收集底部150 μL”对吗？）。请问最后一步是否还需要添加新的外泌露？

答：角转子离心完外泌体不是在离心管底部，要达到缓冲的目的，可能需要加外泌露到没过外泌体附着的侧壁部位，那样不知道使用的具体体积，需要在实际操作中调整；也可以直接加1 mL到底部，在离心的时候外泌露因为比重大也会往侧壁移动，超离完取出离心管时，外泌体就不会附着于侧壁有可能随着外泌露进入底部，收集底部1ml的液体，8管能收集到8 mL；为了提高得率，在弃掉培养上清后，可以再用1 mL PBS重悬下侧壁。这样总共可收集到16 mL浓缩液。这8 mL或16 mL浓缩液就可以转移到sw41水平转子超离纯化。第二次超离纯化时是需要加外泌露的。这次的收集才是分层收的。粗提取液是浓缩液不需要分层收取。

问：使用外泌露提出的外泌体，效率相对经典法如何呢？比如按照常用细胞和往常经验，可以提取多少蛋白量的外泌体。

答：我们有做过外泌体RNA质检，通过外泌露提取的外泌体RNA浓度会降低，但是纯度会更高。能提取到多少蛋白量的外泌体是根据收集的培养液的状态而定的。不同细胞产生外泌体量也不一样，我们使用HEK293T细胞，一般200 mL的培养上清，可以收到2 mg的外泌体。

问：最终的外泌体悬液中，是否一定要将残余的外泌露彻底去除，如不去除会有什么不好的影响吗？

答：如果是进行外泌体的分析，是可以不用去除的。如果是要处理细胞，外泌露浓度含量低于3%（v/v）时是不影响细胞活力的。外泌体可以用PVDF膜的滤器过滤除菌，在低浓度时（<0.3 ug/uL）基本没有什么损失，在高浓度时会有部分损失。