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外泌体、外泌露相关产品Q&A

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【概要描述】

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  • 分类:常见问题Q&A
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  • 发布时间:2020-04-16 21:20
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问:实验室的水平转子型号为sw 41 Ti,这个配套的离心管只能装很少量的体积,使用外泌露前应当需要浓缩,将500 mL上清采用超滤管(100KD)浓缩至低体积,再根据说明书添加外泌露提取外泌体,可行吗?

答:可以利用超滤管浓缩。

问:先采用角转子(8支管,每只管约25mL上清,一次可超离200mL),在每只管里添加外泌露进行浓缩(说明书要求通过预实验,确定加500 μL-2 mL 的外泌露,摸索条件是否以清晰看到分层为准?是否外泌露加的多,分层就更清晰?)。再收集管底部分外泌体粗提溶液(“从底部缓慢小心吸取250 μL 液体,弃去;再收集底部150 μL”是这样操作吗),最后通过sw 41 Ti水平转进行纯化超离(“从底部缓慢小心吸取250 μL 液体,弃去;再收集底部150 μL”对吗?)。请问最后一步是否还需要添加新的外泌露?

答:角转子离心完外泌体不是在离心管底部,要达到缓冲的目的,可能需要加外泌露到没过外泌体附着的侧壁部位,那样不知道使用的具体体积,需要在实际操作中调整;也可以直接加1 mL到底部,在离心的时候外泌露因为比重大也会往侧壁移动,超离完取出离心管时,外泌体就不会附着于侧壁有可能随着外泌露进入底部,收集底部1ml的液体,8管能收集到8 mL;为了提高得率,在弃掉培养上清后,可以再用1 mL PBS重悬下侧壁。这样总共可收集到16 mL浓缩液。这8 mL或16 mL浓缩液就可以转移到sw41水平转子超离纯化。第二次超离纯化时是需要加外泌露的。这次的收集才是分层收的。粗提取液是浓缩液不需要分层收取。

问:使用外泌露提出的外泌体,效率相对经典法如何呢?比如按照常用细胞和往常经验,可以提取多少蛋白量的外泌体。

答:我们有做过外泌体RNA质检,通过外泌露提取的外泌体RNA浓度会降低,但是纯度会更高。能提取到多少蛋白量的外泌体是根据收集的培养液的状态而定的。不同细胞产生外泌体量也不一样,我们使用HEK293T细胞,一般200 mL的培养上清,可以收到2 mg的外泌体。

问:最终的外泌体悬液中,是否一定要将残余的外泌露彻底去除,如不去除会有什么不好的影响吗?

答:如果是进行外泌体的分析,是可以不用去除的。如果是要处理细胞,外泌露浓度含量低于3%(v/v)时是不影响细胞活力的。外泌体可以用PVDF膜的滤器过滤除菌,在低浓度时(<0.3 ug/uL)基本没有什么损失,在高浓度时会有部分损失。

 

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